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Jan 14, 2024

Scientific Reports volume 13、記事番号: 12383 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

コラーゲン I マトリックスに埋め込まれた多細胞腫瘍スフェロイドは、生理学的環境と in vivo 環境の複雑さを反映する固形腫瘍の研究のための一般的な in vitro システムです。コラーゲン I 環境は生理学的に関連しており、細胞侵入を許容しますが、そのようなヒドロゲル内のスフェロイドを研究することは、主要な分析アッセイや幅広いイメージングモダリティに課題をもたらします。これは主に、他のサンプルでは通常切片化によって克服できる 3D ハイドロゲルの厚さによるものですが、コラーゲン I ハイドロゲルはその非常に多孔質な性質のため、特に細胞を含むハイドロゲルのネットワークを保存する方法で切片化するのは非常に困難です。侵入パターン。ここでは、二成分（コラーゲン I とゼラチン）マトリックスで侵襲性スフェロイドを調製および凍結切片するための新しい方法について説明します。これは、三次元サンプルのデュアルヒドロゲル in vitro スフェロイド凍結切片（DISC-3D）と呼ばれる技術です。 DISC-3D は細胞の固定を必要とせず、侵襲性スフェロイドとその周囲の構造を保存し、イメージングの課題を排除し、超解像顕微鏡や質量分析イメージングなどの 3 次元スフェロイド分析ではあまり適用されていない技術の使用を可能にします。。

平らな二次元 (2D) 基板上で培養された細胞の in vitro 研究は 1 世紀以上にわたって採用されており、数え切れないほどの科学的発見において重要な役割を果たしてきました。 2D 細胞培養は分子生物学および細胞生物学における標準的な方法であり続けていますが、2D 細胞培養では 3 次元 (3D) の細胞間相互作用や細胞と環境の相互作用など、生体内システムの重要な側面を再現できないことが長い間認識されてきました。このような相互作用は、明らかに創発的で多細胞である細胞プロセスの研究において特に重要です。たとえば、発生や固形腫瘍の成長と進行などです。

近年、3D 細胞培養の採用が増えています2。ここでは、多細胞実体が細胞株または患者組織から成長または調製され（通常、それぞれスフェロイドおよびオルガノイドと呼ばれます）、生体内細胞外マトリックスを模倣した合成または天然ヒドロゲル中で培養されます。 3 次元細胞培養は、栄養素と酸素の勾配、異なる増殖ゾーン、細胞間相互作用、細胞とマトリックスの相互作用などのヒト組織の生理機能をよりよく再現することが示されており、3D 培養を使用して生物学的疑問を研究する明確な理論的根拠を提供します。本質的には多細胞3、4、5、6。 3D ハイドロゲルの中でも、コラーゲン I 環境は多くの固形腫瘍に対して特に生理学的関連性を示します。乳がんでは、コラーゲン I 密度が高いことが疾患発症の危険因子であることが知られており 7,8、腫瘍周囲のコラーゲン線維の特定の密度と空間組織が予後と関連しています 9。細胞とコラーゲンが豊富な間質微環境との間の相互作用は、膵臓がんにおいても重要であり 10,11 、他のさまざまながんにも関与しているとされています 12。コラーゲン I は、その生化学とネットワーク構造が効率的な細胞侵入をサポートするため、3D 細胞培養にとって魅力的な環境でもあります。さらに、生化学組成を変えることなく、繊維幅、細孔サイズ、ヒドロゲルの剛性などの物理的特性を容易に調整できる環境であり、細胞浸潤モードと効率に対するこれらの特性の影響を研究することができます13、14、15、16。。

3D 細胞培養、特にコラーゲン I ハイドロゲルは、高度な生理学的関連性と、細胞の挙動に関する物理的特性から生化学の重要性を解きほぐす機会を提供することが十分に確立されているという事実にもかかわらず、3D 細胞培養の採用は比較的進んでいます。遅い。抵抗の原因の一部は、そのような環境で高解像度の光学顕微鏡画像を取得する際の課題にあります6。細胞は、少なくとも数十ミクロン、おそらく百ミクロンをはるかに超える距離にわたって環境の硬さを感知し、応答します17。したがって、細胞が等方性 3D 環境と同じように動作するには、硬いイメージング基板の十分上に配置する必要があります。これにより、細胞が一般的な高開口数対物レンズの作動距離を超えたり、画像面の外側からの散乱による高いバックグラウンド信号が発生したり、細胞や細胞周囲のヒドロゲルからの自家蛍光が発生したりする可能性があります。さらに、3D 環境は、サンプルを介した小分子や抗体の拡散を妨げ、これらの状況での薬物研究と蛍光標識の導入の両方を阻害する可能性があります。 3D サンプルに関連する課題は、高い S/N 比が最も重要である超解像光学イメージング、複数のモダリティを使用する相関的アプローチ、質量分析などの非光学的アプローチなど、最も情報量の多いアプローチで特に深刻になる可能性があります。厚いサンプルからの散乱によりサンプル表面以外のデータ収集が不可能なイメージング。

0.05 (n = 12, 59, and 46 slices for 3D, DISC-3D, and DISC-3D re-stained, respectively)./p>

0.05./p> 100 μm into the gel [3D high], and (bottom) following DISC-3D preparation (4 μm slices). From left to right, the columns show images taken using widefield microscopy, confocal microscopy, Airyscan imaging, lattice SIM, and STORM in a HILO implementation. No image is presented for 3D STORM imaging in the top two rows because (3D low) filtering out-of-plane light was insufficient or (3D high) the technique could not be implemented at such depths. Scale bar = 20 μm. (b) Mean measured full width at half maximum (FWHM) of collagen fibers from each microscopy technique. Error bars show standard deviation. Expected minimum FWHM of each approach is shown via dashed horizontal lines. (c) Pore size of collagen networks determined across imaging techniques and sample preparations (see Methods for details). Error bars show standard deviation. Statistical significance, number of samples assessed, and additional information about resolution of each technique are provided in Fig. S4./p> 100 μm into the gel, referred to as 3D high, middle row), and following DISC-3D preparation and cryosectioning (bottom row). All gels investigated were subjected to the first portion of the DISC-3D protocol, the addition and gelation of gelatin. Thus, the only difference between the samples in the DISC-3D images (bottom row) and the other samples (top and middle rows) is that the DISC-3D samples were frozen, removed from the sample wells, and sectioned. First, we note that qualitatively, images of the hydrogel collected near the coverslip appear similar to images of DISC-3D samples across techniques, suggesting that hydrogel structure is not adversely affected by the DISC-3D sample preparation procedure. Generally, DISC-3D samples show enhancements in image quality for all microscopy techniques explored. Widefield microscopy, which suffers from out of plane signal for 3D samples, shows obvious gains in image quality for DISC-3D samples relative to intact 3D samples (Fig. 4a, leftmost column). Confocal microscopy, Airyscan, and SIM, while providing excellent image quality and revealing consistent fiber morphology low in the gel, also show declines in image quality at increased imaging depths (Fig. 4a). We note that imaging at such depths assures the cells interrogated do not sense the underlying stiff substrate; therefore, maximizing image quality in this region is critical for studying cell behavior in a physiologically relevant context. STORM images were poor, and fibers were difficult to discern both low and high in the 3D gels, ostensibly due to challenges filtering out of plane emission in this highly scattering sample, as such filtering is critical to identification and localization of single fluorophores. The enhancement in image quality observed for DISC-3D samples opens the door to revealing details about system microstructure that would not otherwise be accessible in traditional 3D culture contexts./p> 0.95, Fig. S4a). For most microscopy techniques explored here, we find fiber widths larger than the expected fiber thickness of 50–100 nm, consistent with the measured resolutions of these techniques (Fig. 4, Fig. S4c). Given that the true fiber width falls below measured resolutions for widefield, confocal, Airyscan, and SIM, only STORM imaging—which can only be applied to DISC-3D samples—can accurately report fiber thickness (Fig. 4b). Here, we find a fiber width of approximately 75 nm in DISC-3D samples, in good agreement with measurements by electron microscopy and atomic force microscopy46./p> 0.05. (d,e) Representative normalized mass spectra collected from invasive spheroids following the DISC-3D protocol at (d) 24 °C and (e) 350 °C demonstrating the increase in signal intensity in the ≈ 650–900 m/z regime. Number at right on each panel indicates maximum intensity peak at that temperature. (f) Representative mass spectrometry images prepared following the DISC-3D protocol outlined in Fig. S1d, showing consecutive sections of single spheroids for several signal ions. In the first serial section of each signal ion, the spheroid core is marked by a white dotted line and the invasive front is denoted by a red dotted line. Color scale from minimum to maximum intensity is shown for signal ions at right. Scale bar = 500 μm./p>

100 photons) and standard deviation of the fitted Gaussian (> 50 nm and < 250 nm) to remove noise and poor-quality fits. Noise was further reduced by using a DBSCAN-based filter to remove outlier molecules in sparsely populated regions of the imaging area (Epsilon = 50 nm, MinPts = 5). After these post-processing steps, images were drift-corrected using cross-correlation with a bin size of 5. Molecules in post-processed and drift-corrected images were visualized using the “Normalized Gaussian” rendering with a lateral uncertainty set to 10 nm./p> 0.05) is denoted by a dagger (†). A denotes statistical significance and is described in the relevant figure caption when employed./p>

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