プロテオームスケールの研究により、プラスチック表面と撹拌がどのようにタンパク質の凝集を促進するのかが明らかに

Nov 11, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 1227 (2023) この記事を引用

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バイオ医薬品におけるタンパク質の凝集は、その活性と有効性を低下させる可能性があります。また、重篤な副作用の原因となる免疫反応を促進する可能性があります。タンパク質の不安定化に対するプラスチック材料の影響は完全には理解されていません。ここでは、材料表面、空気/液体界面、および撹拌の影響を解析して、タンパク質の不安定化と凝集におけるそれぞれの役割を解読することを提案します。私たちは、精製タンパク質 (ウシ血清アルブミン、ヘモグロビン、α-シヌクレイン) の安定性と、撹拌中の 6000 個の可溶性タンパク質で構成される細胞抽出物に対するポリプロピレン、テフロン、ガラス、および LOBIND 表面の影響を分析しました (P = 0.1 ～ 1.2 W/ kg）。プロテオーム解析により、シャペロニン、本質的に無秩序なタンパク質、リボソームは材料表面と撹拌の複合効果に対してより敏感である一方、小さな代謝オリゴマーは同じ条件下で保護できることが明らかになりました。ラマン顕微鏡、動的光散乱、プロテオミクスと組み合わせたタンパク質損失の観察により、プラスチックによるタンパク質の不安定化の機構モデルを提案することができました。私たちの結果は、タンパク質の損失は主に溶液中の小さな凝集体の核生成によるものではなく、材料表面に露出したタンパク質の不安定化とその後の空気/液体せん断界面での凝集によるものであることを示唆しています。この影響は LOBIND を使用しても防ぐことができません。チューブ。これらの悪影響を最小限に抑える方法に関するガイダンスを確立できます。この複合ストレスの構成要素の 1 つ (材料、空気 (部分的であっても)、または撹拌) を除去すると、タンパク質は保存されます。

タンパク質ベースの治療薬の数は急速に増加しています。ただし、タンパク質は製造中にストレスにさらされ、その安定性に影響を与えます。バイオ医薬品におけるタンパク質の凝集は、その活性や有効性を低下させる可能性がありますが、アレルギー反応やアナフィラキシーなどの重篤な副作用の原因となる免疫反応を促進する可能性もあります1。

局所環境およびプロセスを慎重に制御するか、サンプリング前に凝集体を除去することにより、バイオ医薬品処理中のタンパク質の凝集を回避するためのさまざまな戦略が開発されてきました。タンパク質の安定性を決定したり、タンパク質の凝集を引き起こしたりする物理的および化学的要因は、薬学および生化学の分野で長い間研究の対象となってきました。撹拌、温度、pH、イオン強度がタンパク質の凝集を誘発することが知られています1、2、3。

バイオ医薬品処理におけるタンパク質の安定性に対する材料の影響は、比較的研究されていません。実際、現在の状況は長い間、表面への吸着によるタンパク質の損失が最小限に抑えられ、タンパク質と材料の相互作用は表面の不動態化のみをもたらし、溶液中に残っている遊離タンパク質には影響を与えないというものでした。 1970 年代から、Leo Vroman4,5 は、タンパク質の吸着は静的なプロセスではなく、タンパク質の濃度と表面に対する親和性に応じて、遊離タンパク質と吸着タンパク質の間の液体-固体界面で交換が起こる動的プロセスであることを実証しました。このモデルは、表面との弱い相互作用とその後の溶液中での放出に続くタンパク質の安定性の部分的な喪失によって完成することができます6。これは界面の遠隔効果への最初のステップです。

最近の研究では、タンパク質の安定性に対する固体/液体界面の不安定化効果は、当初考えられていたよりも深刻であり、撹拌によって増強される可能性があることが実証されました。抗体凝集に対する流れと表面の相乗効果はすでに記載されています7、8。他の研究では、気泡の役割が強調されています9,10。これらの観察は、バイオ医薬品の製造における新しいプロセスや材料の効果を考慮する際には、固体/液体、空気/液体界面、および撹拌の両方が重要な役割を果たすことを示唆しています。しかし、関与するプロセスや、タンパク質の安定性に関わるさまざまな界面と撹拌の間の相互作用を説明できる機構の説明は欠けています。さらに、ほとんどの実験研究は単一の精製タンパク質を使用して実施されており、異なるタンパク質が関与する場合のタンパク質間相互作用の役割、界面でのタンパク質複合体の会合と解離の可能性11、およびこれらのストレスに対するタンパク質感受性の変動を説明できません。

1 µm) were identified in the protein solutions after wheel rotating agitation in PP tubes. Optical microscopy using reflected light and contour reconstruction with Fiji software were applied to better visualize their shape and structure (Fig. 7A). The size of the objects ranged from a few to tens of micrometers, though no inner structure could be seen./p> 1) (see supporting file proteomic-SI2 for the protein list). Among these proteins, 58 proteins were highly depleted and 31 proteins were highly enriched, taking a threshold of minimum 15% concentration variation after mixing. No significant differences were observed as a function of the material, with most depleted and most enriched proteins observed for all the different types of surfaces. Highly enriched and highly depleted proteins were classified as complexes, oligomers, chaperonins, partially unfolded proteins or IDPs, and others (Fig. 11)./p> 1) or not (BFsim ≤ 1). The depletion of a given protein was assessed using a majority voting decision rule on 100 simulations. Proteins with simulated low abundances (quantities < 5 fmol) were removed in accordance to the LOD and LOQ determined experimentally. The results of the simulation for PP surface are shown in Fig. 12. The line depicts the simulated number of depleted proteins to achieved the target mass loss. For PP surface, to achieve a 15% mass loss, 125 proteins needed to be non selectively depleted, whereas only 58 are in the experiment. Our analysis shows also (supporting information part SF) that about 80% of the depleted proteins identified experimentally by proteomic show a stronger depletion than proteins from the simulated dataset. These two results demonstrate that protein depletions above 15% in the system are not due to a random process but rather to a selective depletion from the extract./p>

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